奥地利维也纳兽医大学Iwan Anton Burgener团队在《Journal of visualized experiments》 期刊发表最新测度恶果，描写了一种从步伐基质包埋的类器官培养物中生成尖端向外肠类器官的有缠绵，并概括了随后将胸苷类似物5-乙炔基-2'-脱氧尿嘧啶（EdU）掺入活跃增殖的细胞中以及EdU阳性细胞的半自动定量。
著作先容
题目：尖端向外肠类器官的生成和EdU标记类器官增殖率的评估 杂志：Journal of visualized experiments 影响因子：1.2 发表时刻：2025年3月张开剩余93%#1
测度布景
Background
本文描写了通过水凝胶包埋肠谈类器官培养物生成尖端向外肠类器官的飞舞培养物，并开拓了用于相比的基底向外肠类器官培养物。
测度中，尖端向外和基底向外肠类器官露馅于EdU，该化合物在细胞分裂的S期会整合到新合成的DNA中。这一过程不错通过激光扫描共聚焦显微镜进行可视化，并诈欺图像分析软件半自动定量Hoechst33342和EdU标记的细胞，从而诡计EdU阳性细胞在总细胞中的比例。
这种方法不仅适用于肠谈类器官的增殖分析，还不错用于其他类器官或二维细胞培养物的细胞增殖测度。
#2
测度念念路
Methods
开拓肠谈类器官培养体系 教化极性回转 EdU标记细胞增殖 相比尖端向外和基底向外类器官 图像分析与数据管制#3
测度想象：
Design
责任经过包括类器官培养、极性回转教化与EdU标记、Click-it EdU染色反映和Hoechst 33342染色、半自动图像分析、类器官增殖率的测定。
#4
代表性限定
Results
瞎想的类器官大小应在50-250 μm之间（图1A），过大的类器官可能无法有用地回转极性，并可能运转出芽，影响极性回转。在格式学上，基底向外类器官和尖端向外类器官有明白区别。
基底向外类器官保捏较大的腔室（图1B），而尖端向外类器官则更紧凑（图1C），且周围飞舞着死字细胞，这些死字细胞是由尖端向外类器官排出到培养基中的。相较之下，基底向外类器官在腔内积聚死字细胞。
图1 极性逆转教化前后的类器官格式。(A) 胰酶消化后的肠类器官细胞在助长培养基中培养3天后造成的基质包埋态。(B) 悬浮培养3天后造成的基底向外类器官。(C) 在不添加BME基质的悬浮培养体系中培养3天教化造成的顶膜向外类器官（极性逆转态）。比例尺=200 μm。
在细胞增殖分析方面，使用EdU标记新合成的DNA后，基底向外类器官在时刻推移中推崇出更高的EdU信号（图2）。关联词，并非统统类器官王人有EdU+细胞，部分类器官在特定成像层中可能不夸耀EdU+信号。
图2 EdU标记的基底向外与尖端向外肠类器官。上图夸耀基底向外类器官随时刻变化的共聚焦图像，在交流时期点下，其EdU阳性细胞数目显赫多于下图所示的尖端向外类器官。比例尺=100 μm。
通过图像分析软件，类器官领先被圈出（图3A），然后摒除不联系的区域（图3B）。接着自动分析经过对细胞核进行分割，辞别Hoechst33342+和EdU+细胞核，同期摒除小于15 μm²的细胞核（图3C）。
图3 EdU染色肠类器官的定量图像分析限定。（A）收受球形及多边形模式对类器官进行圈选。（B）分析中需摒除的区域以白色标记（箭头所示），该区域为类器官腔体，内含部分死细胞，后续分析中将赐与剔除。（C）分析后的图像夸耀统统分割后的细胞核：Hoechst33342阳性核标记为蓝色，EdU阳性核标记为黄色，未达到15 µm2的细胞核分别用绿色（Hoechst33342）和橙色（EdU）标注。比例尺=50微米。
最终定量分析EdU+信号占总DNA量的百分比（图4）。测度发现，尖端向外类器官的增殖水平显赫低于基底向外类器官。
图4 类器官增殖速度分析。以EdU阳性DNA占总DNA的百分比看成类器官增殖速度的表征目的，限定夸耀基底向外类器官的增殖活性显赫高于尖端向外类器官。
试验智商
类器官培养
1. 将成东谈骨干细胞开端的肠类器官包埋于基底膜索要物（BME）中，接种于24孔板，使用玻璃移液管进行机械传代。
注：在本试验有缠绵中，使用了Geltrex看成BME。
2. 防卫吸除包埋类器官的优化培养基。
3. 每孔加入500 µL 0.05%胰卵白酶-EDTA，吸吹将统统基质圆顶从孔均分离。将类器官鬈曲至15 mL离心管，充分重悬以透彻解离水凝胶基质。
4. 将类器官与0.05%胰卵白酶-EDTA于37℃水浴中孵育，直至绝对解离为单细胞或小细胞团。
5. 用基础培养基稀释胰卵白酶/细胞悬液，基础培养基体积至少为胰酶的2倍。
6. 420 g、8℃离心5分钟，尽量去除上清。
7. 将细胞重新包埋于BME中，接种至与智商1交流数目的孔板，并补充优化培养基。
8. 于细胞培养箱中孵育3天，随后进行智商2的操作。
极性回转教化与EdU标记
1. 防卫吸除BME包埋类器官中的培养基。
2. 每孔加入500 µL的类器官成绩溶液，并通过反复吸吹将统统基质圆顶从孔均分离。将类器官鬈曲到15 mL离心管中，并充分重悬以绝对分离水凝胶基质。
3. 将15 mL离心管置于冰上孵育1.5小时。每隔10分钟充分摇晃试管，以精通类器官集结并确保剩余水凝胶因素均匀分离。
4. 孵育时期，用抗粘附溶液包被96孔板。按24孔板每孔对应8孔96孔板的比例进行包被，室温孵育至少1小时。
5. 向15 mL管中加入至少两倍于类器官成绩溶液体积的PBS，并在8℃下以150 g离心5分钟。
6. 移除上清液，将类器官重悬于1 mL的PBS中。
7. 将500 µL的类器官/PBS悬浮液鬈曲到另一个15 mL离心管中，并再次8℃下以150 g离心5分钟。
8. 弃去96孔板中的抗粘附溶液。
9. 离心后，尽可能移除上清液。
10. 使用一个试管用于生成悬浮培养的基底向外（BO）类器官，另一个试管用于尖端向外（AO）类器官。
11. 关于BO类器官，在一个试管中，向96孔板的每个孔中加入100 µL含有7.5% BME的精制培养基。充分搀杂，并将类器官均匀散布到预包被的96孔板的所需孔数中。
12. 关于AO类器官，在另一个试管中，向96孔板的每个孔中加入100 µL不含BME的闲居精制培养基。充分搀杂，并将类器官均匀散布到预包被的96孔板的所需孔数中。
13. 在37°C和5% CO₂下孵育类器官3天。
注：格式学相反将在第1天后运转败露。关联词，先前发表的限定标明，简短需要3天时刻，大多量类器官才智呈现出尖端外极性。
14. 在教化极性回转后的特定时刻点，向统统待标记的类器官孔中加入50 µL稀释在精制培养基中的3 µM EdU，使每个孔的最终浓度达到1 µM EdU。
15. 在37°C和5% CO₂下孵育1.5小时。
16. 使用宽口径吸头汇集EdU标记的类器官，并将其鬈曲到15 mL离心管中。
17. 向每个试管（BO和AO类器官）中加入等量的4% PFA（最终浓度为2% PFA），并防卫搀杂。
18. 在室温下孵育15分钟。
19. 向15 mL管中加入至少两倍于管内体积的PBS，并在8℃下以150 g离心5分钟。
20. 移除上清液，将类器官重悬于1 mL的PBS中。
21. 再次在8℃下以150 g离心5分钟。
22. 移除上清液，将类器官重悬于1 mL的PBS中，并将其鬈曲到1.5 mL离心管中。将类器官保存在4℃，直至进行EdU染色反映
23. 访佛智商14-22，以分析每个时刻点。
Click-it EdU染色反映和Hoechst 33342染色
1. 在4℃下，以50 g离心固定后的类器官5分钟。
2. 移除上清液，使用宽口径吸头将类器官重悬于1 mL的3%牛血雪白卵白（BSA）溶液中（用PBS稀释）。
3. 访佛智商1和2。
4. 移除上清液，将类器官重悬于1 mL的0.5% Triton X-100溶液中（用PBS稀释）。
5. 在室温下孵育20分钟。
6. 在室温下以50 g离心类器官5分钟。
7. 在一个新的试管中，通过搀杂45 µL的水和5 µL的10x Buffer Additive来准备1x Buffer Additive。
8. 在另一个试管中，通过搀杂以下因素来准备反映搀杂液：385.8 µL的水、43 µL的10x反映缓冲液、20 µL的CuSO₄、1.2 µL的Alexa Fluor 647叠氮化物和50 µL的1x Buffer Additive。
注：这种搀杂液实足进行五次染色反映，可凭据需要的染色反映数目进行退换。
9. 访佛智商1和2两次洗涤。
10. 移除上清液，向每个含有类器官的试管中加入100 µL的反映搀杂液（来自智商8）。
11. 在室温下在迷蒙中孵育30分钟。
12. 访佛智商1和2洗涤。
13. 在室温下以50 g离心类器官5分钟。
14. 将类器官重悬于1 mL的10 µg/mL Hoechst 33342溶液中（用PBS稀释）。
15. 在室温下在迷蒙中孵育45分钟。
16. 访佛智商1和2洗涤。
17. 在4℃下以50 g离心类器官5分钟。
18. 将类器官汲引在合乎共聚焦显微镜成像的基底膜索要物（BME）基质中。
19. 在共聚焦显微镜下对类器官进行成像。
半自动图像分析
1. 将共聚焦显微镜图像导入图像分析软件，并界说一个文献夹用于保存分析文献。使用“将图像看成时刻点”选项导入多张图像（包括访佛图像、不同时期点、不同管制等）。每张图像将被视为一个单独的时刻点，便于在各个图像之间切换。
2. 掀开分析面板，并导入看成补充文献1提供的分析经过（arivis_EdU_pipeline）。
3. 使用“舍弃新对象”器用和标记为“Organoid”的“球体”器用，轻松圈出统统分离细致的类器官。
4. 切换到下一张图像，即下一个时刻点，并陆续标记统统图像中的类器官。
5. 关于彼此卓绝会聚、无法使用“球体”模式分离的类器官，掀开对象列表并激活“Organoid”标记。
6. 陆续使用“绘画对象”器用的“多边形”模式手动标记类器官轮廓。
注：在对象列表中，统统类器官当今王人已标记并分派到特定的时刻点。这些时刻点对应于智商1中导入的图像章程。若是需要，不错将这些时刻点重定名为与原始图像称号一致。
7. 在对象列表中，标记统统对象（=类器官），右键单击，然后点击“移除标记”，以移除统统对象的“手动”标记。
8. 在对象列表中停用“Organoid”标记，并使用“绘画对象”器用的“多边形”模式标记统统应从分析中摒除的区域。这些区域可能包括类器官腔内的死字细胞或朦胧区域，这些区域可能会侵扰分析。
9. 掀开对象列表时，确保统统类器官王人标记为“Organoid”，统统应摒除的区域王人标记为“手动”。
10. 点击左上角的箭头启动分析经过。
注：软件当今将分割Hoechst33342和EdU通谈中的统统细胞核。此分析经过仅有计划大于15 µm²的分割后的Hoechst33342+和EdU+细胞核（即细胞核区域的面积），以确保摒除可能开端于死字细胞的小细胞核。
11. 通过点击“特征列”标签，在对象列表中稽察分析限定。
12. 切换到“主从视图”，在上部面板中选择“类器官”标记和“第一时刻点”特征。
13. 鄙人部面板中，选择要夸耀的每个类器官的特征。使用投影（x/y/z）面积（体素）、平均强度#1（EdU通谈）和步伐差强度#1。
14. 使用Excel导出功能导出限定（主从呈报）。
15. 保存分析文献并关闭软件。
类器官增殖率的测定
1. 掀开导出的“主从呈报”文献。
2. 每个分析的图像王人有一个单独的标签页。
诡计每个图像中细胞核和EdU染色的面积/体素总额。
然后，将统统限定数据复制到一个新的汇总标签页中，并将统统属于统一时刻点的数据分组。
3. 然后，诡计每个图像中细胞核的总面积（即Hoechst33342+面积和EdU+面积的总额）。
4. 接下来，将总面积除以本人（=100%），并将平均EdU+面积除以总面积（=EdU+DNA的百分比）。
5. 在y轴上绘画BO和AO类器官的增殖性DNA的百分比，在X轴上绘画不同的时刻点。
小结
本测度收效开拓了尖端向外肠谈类器官的培养方法，并通过EdU标记和半自动图像分析技艺评估了其细胞增殖率。测度限定标明，尖端向外类器官的细胞增殖率显赫低于基底向外类器官，这可能是由于极性回转后细胞死字率加多所致。
尽管尖端向外类器官在细胞增殖方面存在局限性，但它们为测度细胞尖端名义的功能提供了新的器用，独特是在代谢测度和感染性疾病测度中具有紧要应用出路。
基础培养基与优化培养基配方
参考文献
Csukovich G, Wagner M, Schmidhofer K开yun体育网, Pratscher B, Burgener IA. Generation of Apical-Out Intestinal Organoids and Assessment of Organoid Proliferation Rate Using EdU-Labeling. J Vis Exp. 2025 Mar 28;(217). doi: 10.3791/68039.
发布于：江苏省